Spaceyak

有时候FISH检测会发现荧光信号很暗，甚至连DAPI也如同雾里看花，蒙蒙的一层，这时记得把滤光片拆下来对着光仔细观察，很有可能是滤光片发霉造成的。南方最近多雨天气已经造成N多滤光片发霉了。

无论是那种细胞遗传学研究，都需要使用合适的技术进行制片。制片方法根据对象（羊水细胞、淋巴细胞、实体肿瘤、白血病）和实验目的（各种染带、FISH、CGH、M-FISH）的不同而有所变化，但一般都包括下面几个步骤：

1、细胞培养：尽管细胞类型千差万别，但最终目的都是实现细胞增殖和分化，达到理想的分裂周期。

2、细胞收获：通常使用秋水仙碱对细胞周期进行阻滞，以使其停滞在分裂中期。然后使用低渗液使目标细胞肿胀，并去除破裂的红细胞。低渗后使用固定液来保持细胞的肿胀状态并去除水分，使细胞成分“硬化”。通常使用的固定液（3：1 甲醇：冰醋酸）可以去除脂类物质并使蛋白变性，从而使细胞膜变得脆弱，有利于后面的铺片步骤进行。

3、制片：将细胞悬液滴在玻片上，以特定方式干燥，从而使染色体在玻片上展开。

4、老化：使用高温和/或乙醇的方法变性蛋白质并从玻片上去除水分和固定液，增强细胞组织在玻片上的附着力。

5a、显带：对展开的染色体进行染色使其显带并在镜下观察。

5b、预处理、变性和杂交：FISH操作步骤，使其获得最大的杂交效率并观察其荧光信号。

各个实验室可能使用不同的步骤和试剂进行上述操作，大多数方法都能取的不错的效果，主要影响因素可能包括：空气湿度、低渗液、蒸馏水的质量、过期固定液等。最容易导致染色体制备失败的因素是空气的湿度，此外失效的低渗液、蒸馏水或过期的固定液也会对结果造成不利影响。

在这里提供的方法是一种简单且易于重复的技术，并且与空气湿度无关。它独特之处在于细胞悬液干燥时的处理，通过使用热蒸气干燥并在镜下观察，几乎所有的细胞都能获得良好的伸展状态，从而适合FISH、G显带等后续检测。

原文地址：http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/slide01.html

可能原因包括：

1、不适合的探针量

2、不适合的杂交后洗

3、样本中有过多的重复序列

解决方法包括：

1、使用合适的探针量

2、改善杂交后洗环节：

a、准备新鲜配制的洗涤液；b、检查洗涤液的pH、c、检查水浴缸的温度（71-73度，一次不超过6片洗涤，每次洗涤后重新升温）；d、洗涤时震荡洗涤缸；e、延长洗涤时间（最长5分钟）。

3、使用DNA阻断剂，如Cot-1 DNA等，参考：使用COT-1 DNA来降低FISH检测中的背景信号

福尔马林固定石蜡包埋的组织需要用蛋白酶进行消化以去除多余的组织来暴露细胞。

如果消化不足（酶浓度低、温度不适合、时间太短），镜下会出现云雾状组织覆盖在细胞上，无法观测到暴露独立的细胞核，从而降低杂交效率并很难选择细胞进行计数，这种情况需要重新制片。

如果消化过度，则细胞核被损伤，失去正常的圆形完整形状，变得支离破碎，甚至像鬼影一样，这种情况只能重新制片。

血液学荧光原位杂交指南
（以BCR-ABL探针为例）

Mark W. Drummond, Elaine K. Allan, Andrew Pearce and Tessa L. Holyoake

翻译：黄劭

mailto: huangshao@gmail.com

1. 简介

BCR-ABL融合基因由9号染色体和22号染色体相互易位而成，形成费城（Ph）染色体（小的22号染色体），在95%的慢性粒细胞白血病（CML）患者中能检测到此融合基因¹。22q11的BCR基因和9q34的ABL基因融合形成活性的BCA-ABL蛋白酪氨酸激酶^2,3。动物实验显示此融合蛋白能诱导小鼠患CML类似的疾病，提示此变异在CML及其它白血病（20%成人急性淋巴性白血病和较少的慢性嗜中性粒细胞白血病）发病中的重要地位。因此，检测BCR-ABL易位对于临床治疗和研究都具有重要意义。由于BCR-ABL阳性细胞没有典型的表面标志物，因此只能用分裂中期（MP）细胞核型分析、RT-PCR或荧光原位杂交（FISH）的方法进行检测。FISH的优点在于可以对分裂间期（IP）细胞进行检测，极高的灵敏度和检测隐形易位的能力。因此，使用FISH对骨髓或外周血标本的BCR-ABL阳性细胞数进行定量有助于对临床治疗进行监测。同样，在研究上，也可以对单独的细胞克隆或分选的细胞进行分析。

最早的FISH技术使用S-FISH探针，分别对BCR和ABL基因用荧光进行标记^4,5。但在IP细胞中，由于信号随机分布的原因，许多邻接的分离信号看上去类似融合信号，导致出现了大量的假阳性细胞⁶。而在MP细胞中，假阳性细胞的比例有所下降。ES-FISH探针在ABL探针的5’端增加了一段序列，使假阳性的比例大为下降，同时可以检测变异9号染色体的缺失⁷。D-FISH在ABL和BCR探针的5‘短都加入了额外序列，从而可观察到BCR-ABL和ABL-BCR两个融合信号⁸。ES探针和D-FISH探针都可以检测变异的9号染色体上靠近断裂点的可能缺失⁹。这种缺失在约15%的患者身上出现，提示明显较差的预后¹⁰。检测这种缺失对于选择合适的治疗方案开始变得重要。

下面将介绍FISH的操作步骤，包括外周血、骨髓、流式分选细胞、长期培养起始细胞（LTCIC）的预处理、探针的选择和经典FISH流程。注意不同的探针使用方法可能不同，需要参考生产商的使用说明。

2. 准备材料

所有的玻璃器皿必须使用0.5%（v/v）Decon消毒并用流水彻底冲洗。塑料制品和溶液必须保持无菌。

2.1. 样品收集

1. 灭菌肝素钠（10,000 units/L）
2. 锂-肝素血收集管

2.2. 白细胞计数和样品制备

1. 细胞培养管
2. 血清移液管（10 mL）
3. 组织培养液：RPMI 1640和HEPES液，添加20%胎牛血清。

2.3. 收集培养的BM/PB

1. 秋水仙碱
2. 纯甲醇：冰醋酸固定液（3：1，v/v）

2.4. 玻片制备

1. 0.5%（v/v）Decon-90消毒液
2. 70%乙醇
3. 磨砂玻片
4. 多孔显微镜用玻片
5. 多聚赖氨酸（PLL），0.1%（w/v）
6. 塑料Coplin缸

2.5. 制备中期/间期细胞核

1. 10X NH4CL，8.3%（w/v）
2. PBS：0.01M 磷酸缓冲液，0.0027M KCL，0.137M NaCl，pH 7.4）
3. 10X 低渗液：0.75 M KCl
4. 固定液：甲醇：醋酸 3：1（必须使用新鲜配置的试剂）
5. 钻石笔
6. 倒置显微镜
7. 相差显微镜
8. 玻璃或塑料Coplin缸（50 mL）

2.6. FISH步骤

1. 20X SSC（pH 7.0），使用前用HCl或NaOH进行pH校正
2. 变性剂：70%甲酰胺，溶于2X SSC
3. 2X SSC，pH 7.0
4. 0.5X SSC，pH 7.0，用于杂交后洗
5. 玻璃Coplin缸
6. 微量离心管（0.2或1.5 mL）
7. NP40或Tween
8. 乙醇：70%，80%，95%
9. 玻璃盖玻片（22 x 22，22 x 50，26 x 25 或18 x 18 mm）
10. DAPI，终浓度0.05-0.1 μg/mL，用抗淬灭剂保存
11. 封口胶
12. 湿盒
13. 37度孵箱
14. 移液器和枪头
15. 水浴锅37度和72度，72度水浴锅需放置于通风橱内
16. 探针和缓冲液
17. 落射荧光显微镜（100-W 水银灯泡和所需的滤光片），带x10和x100（油镜）物镜
18. 镜油

3. 实验方法

3.1. 外周血和骨髓样品收集

3.1.1. 骨髓

将2-5 mL外周血加入盛有15 mL无菌肝素钠（10000 U/mL）的容器中（见注释5）。

3.1.2. 外周血

在肝素锂管中收集10 mL外周血。

3.2. 骨髓（或外周血）准备和培养（为中期FISH）

1. 用无菌移液器吸取0.5 mL的整数倍量的骨髓/外周血到一只Bijou管中，用血球计数仪进行细胞计数。
2. 室温下对外周血/骨髓离心，200g，8分钟。
3. 用无菌移液器去除血浆，确保 血沉棕黄层保持完整。
4. 在细胞计数的基础上，使用10 mL带刻度的无菌移液管将组织培养液（RPMI加20% 胎牛血清）加入剩下的细胞中（血沉棕黄层和红细胞），使终浓度为1 x 10⁷ cells/mL。
5. 使用10 mL带刻度的无菌移液管，加4.5 mL组织培养液到一只标记过的培养管中。
6. 使用带刻度的无菌移液器，加0.5 mL稀释后的骨髓到培养管中，并使用移液器进行温和的混匀（此时管中细胞的终浓度为1 x 10⁶ cells/mL）。
7. 将培养管置入37℃孵箱孵育24小时。

3.3. 收获和固定培养的骨髓/外周血细胞（为中期FISH）

1. 37℃孵育24小时后，加入50 μL秋水仙胺到培养管中。
2. 将培养管放回孵箱，37℃孵育1小时。
3. 孵育结束后，将培养管200g离心8分钟。用无菌移液器吸去上清，不要触动细胞团块。
4. 在漩涡振荡器上轻轻混匀细胞团块，用一次性移液管加入3 mL低渗KCl，再次混匀。
5. 将培养管置入孵箱，37℃孵育10分钟。
6. 孵育结束后，将培养管200g离心8分钟。
7. 使用无菌移液器吸去上清。
8. 用漩涡振荡器轻轻混合细胞，防止细胞成团。使用移液器缓慢加入1 mL甲醇：醋酸固定液。
9. 边在漩涡振荡器上混合，边加入2 mL固定液。
10. 200g离心8分钟。
11. 吸去上清，使用漩涡振荡器重悬细胞，加入3 mL固定液。
12. 重复步骤11和12两次，每次减少1 mL固定液用量（第1次重复用2 mL，第2次重复用1 mL）。
13. 储存于-20℃。

3.4. 间期FISH从全血标本中固定外周血单核细胞（不需前面的培养步骤）

1. 用无菌蒸馏水准备1:10稀释的10X NH₄Cl溶液
2. 在盛有10 mL 1X NH₄Cl 的15 mL无菌圆锥管中加入1 mL全血裂解红细胞。37℃孵育10分钟，孵育期间进行温和颠倒混合。
3. 室温下450g离心5分钟。
4. 弃去上清。
5. 用PBS重悬洗涤细胞。
6. 重复离心步骤。
7. 用1 mL PBS重悬细胞并用血细胞计数仪进行计数。
8. 离心细胞并弃去上清。
9. 加入10 mL预温（37℃）的低渗液。
10. 轻轻颠倒以混合细胞。
11. 室温孵育10-20分钟。
12. 加入2 mL新鲜制备的固定液，室温孵育5分钟。
13. 450g离心5分钟。
14. 弃去上清，用10 mL固定液重悬细胞。
15. 室温放置5分钟。
16. 450g离心5分钟。
17. 重复14-17步至少2次。
18. 用固定液重悬细胞，使终浓度为1 x 10⁶ cells/mL，置于-20℃保存。

3.5. 准备玻片

多孔玻片包含10或12个单独的孔，常规性用于少量固定细胞样本的观察。与普通的标准显微镜玻片比，因为细胞被局限于相对较小的表面区域里，因此可以在FISH观察中提供更合适的细胞密度，同时由于细胞数下降，也节约了探针的用量。同样，阴性对照和阳性对照的细胞也可以放在一张玻片上以供观察。对于特定低数量的细胞类型而言（如CD34⁺细胞），玻片必须预包被PLL以促进细胞的粘附（详情见下）。3.7.章节会提供流式细胞仪分选后细胞的固定和玻片准备方法。

1. 在0.5% Decon90清洁剂中浸泡玻片1小时。
2. 用流水清洗玻片1-2小时，并不时震动。
3. 用纸巾干燥玻片上多余的液体。
4. 将玻片保存于70%乙醇以供使用。

3.5.1. PLL包被玻片

1. 将玻片从70%乙醇中取出，浸入冷的自来水中并干燥。
2. 用无菌蒸馏水1:10稀释 0.1%(w/v) 的PLL溶液。
3. 将0.01%PLL倒入Coplin缸，将玻片室温放置于缸中5-10分钟进行PLL包被。
4. 风干玻片1-2小时或过夜。
5. 室温保存玻片。
6. 继续下面的细胞固定步骤。

3.6. 从固定的细胞中准备中期/间期FISH用细胞

1. 将细胞从-20℃取出并恢复至室温。
2. 200g 5分钟离心细胞。
3. 弃去上清，用巴斯德移液管加入新鲜的固定液重悬细胞以得到所需的细胞密度。固定液体积必须足够低，使重悬液具有乳状外观。
4. 将玻片从70%乙醇中取出，浸润在较冷的自来水中。
5. 吸去玻片上多余的液体，留下一层薄的水膜。
6. 快速吸数滴细胞悬液到巴斯德移液管中。
7. 将玻片垂直拿起，磨砂的一端朝上，将玻片略微向远离操作者的方向的转动。将移液管的末端接触磨砂处的下端，然后移过整张玻片，同时将玻片慢慢转向操作者，使细胞能平均的分布在整张玻片上。
8. 将玻片以45度角竖直放置，室温干燥玻片。
9. 使用相差显微镜检查玻片的质量和间期细胞核的分布，用钻石笔标记希望检查的区域。细胞应当脱离胞浆并彼此不接触（见注解6）。

3.7. 对流式细胞仪分选的细胞进行固定和制片

1. 转移约5000个PBS悬浮的细胞到一个0.2 mL PCR管中，700g离心5分钟。
2. 小心地移去上清，不要触动细胞。
3. 用50 μL 37℃预温的低渗液进行重悬。
4. 根据重复检测情况等比加入PLL预包被的多孔玻片孔中。
5. 室温孵育20分钟，然后小心地移去多余的低渗液。
6. 用显微镜进行观察，确保孔内有足够细胞用于FISH检测（>1000，见注解7）。
7. 向每孔内加入20 μL新鲜配置的固定液。
8. 室温孵育5分钟。
9. 小心地移去多余的固定液，加入30 μL固定液孵育5-10分钟。
10. 重复第9步。
11. 将玻片转移到盛有固定液的塑料Coplin缸中，至少固定5分钟（如果需要可以过夜）。
12. 风干数小时或过夜。
13. 进行后续的FISH实验，或用封口膜包裹并储存于-20℃。

3.8. 为间期FISH对LTCIT和CFC集落进行固定和制片

1. CML患者的LTCIC集落可直接从甲基纤维素膜上摘下并固定于多孔玻片上以进行FISH检测。多个集落可与阴/阳性对照一起放置在多孔玻片上进行观察。如果集落特别小，可以把它们混合在一起再固定。下面的步骤将去除部分甲基纤维素，以免对后续的FISH实验造成干扰。

3.8.1. 小集落

1. 向PLL预包被的孔中加入25 μL 37℃预温的低渗液。
2. 用倒置显微镜确定集落的位置。用20 μL移液器枪头吸取细胞集落并尽可能少的吸到甲基纤维素（1-2 μL）。
3. 小心的将挑取的细胞集落加入到玻片上预温的低渗液中，将枪头上所有的细胞都小心地洗下来。
4. 室温孵育孔中的细胞20分钟。
5. 室温孵育20分钟，然后小心地移去多余的低渗液。
6. 用显微镜进行观察，确保孔内有足够细胞用于FISH检测（>1000，见注解7）。
7. 向每孔内加入20 μL新鲜配置的固定液。
8. 室温孵育5分钟。
9. 小心地移去多余的固定液，加入30 μL固定液孵育5-10分钟。
10. 重复第9步。
11. 将玻片转移到盛有固定液的塑料Coplin缸中，至少固定5分钟（如果需要可以过夜）。
12. 风干数小时或过夜。
13. 进行后续的FISH实验，或用封口膜包裹并储存于-20℃。

3.8.2 大集落

1. 挑取集落，加入含100 μL PBS的0.2 mL PCR管中。
2. 700g离心5分钟。
3. 用25 μL低渗液重悬。
4. 加入多孔玻片中。

3.9. FISH 探针

3.9.1. 探针的选择

S-FISH：S-FISH探针只检测一条染色体上的变异，如BCR-ABL探针只检测22号染色体上的变异。由于细胞核中信号位置随机变化的原因，S-FISH探针很容易出现假阳性情况。因此，S-FISH探针比较适合用于样品中高比例细胞存在易位的情况。

ES-FISH：BCR-ABL的ES-FISH探针除了检测BCR基因和ABL基因外，还跨越到ASS基因的区域（9号染色体上，ABL基因的染色体中心侧）。对于存在t(9:22)易位的细胞而言，除了检测到一个融合信号（黄色）、一个正常的ABL信号（红色）和一个正常的BCR信号（绿色）外，还能看到变异的9号染色体上一个红色信号，由此可以降低假阳性的几率。

D-FISH：BCR-ABL的D-FISH探针同时检测9号染色体和22号染色体上的变异。在一个存在t(9:22)易位的细胞中，可观察到两个融合信号（黄色）和两个正常的单独信号（一红一绿）。D-FISH探针假阳性的几率较少，因此比较适合用于那些变异细胞比例较少的样本，如临床观察残留病灶时使用。

3.9.2. 经典FISH步骤

所有商业化探针的FISH操作步骤请参照相应的说明书，其方法可能和下面的经典流程有所不同。

1. 将玻片从-20℃取出并恢复到室温。
2. 在玻璃Coplin缸中加入 pH 7.0的2X SSC/0.5% NP40溶液（预温到37℃），将切片在缸中孵育30分钟（见注解8）。
3. 将玻片从缸中取出，室温下在70%、80%、95%的乙醇中依次放置2分钟进行梯度脱水。
4. 风干玻片。
5. 将玻片浸入pH7.0，预温至72±2℃的 70%甲酰胺/2X SSC溶液中变性两分钟（变性液的pH值必须为7.0，温度为72度，用温度计直接检测缸内溶液的温度）。
6. 用冰乙醇重复步骤3、4来终止变性并脱水，玻片可放置在95%乙醇中待下一步操作。
7. 将装有探针的管放置于37℃5分钟。
8. 吸取合适量的探针到一个包裹了锡纸的0.2 mL离心管中（多孔玻片约每孔2.5 μL，普通玻片使用22 x 22 mm盖玻片时约需8-10 μL）。
9. 72±2℃变性探针5分钟。
10. 将装探针的离心管离心2-3秒。
11. 将装探针的管置于37℃待使用。
12. 当探针变性到最后两分钟时，将玻片从95%乙醇中取出，放于45℃烤片机干片。
13. 将探针加在待检测区域上并迅速盖上盖玻片。对多孔玻片而言，盖玻片面积根据所使用的孔决定。注意盖玻片下不可有气泡，不然会妨碍探针与细胞接触。
14. 用封片胶封住盖玻片。
15. 将玻片放入预温的湿盒中，置于37℃孵箱杂交16小时。

3.9.3 洗片

1. 将50 mL 0.5X SSC加入玻璃的Coplin缸中，水浴升温至72±2℃，保持该温度至少30分钟。
2. 将另外50 mL 2X SSC加入一个锡纸包裹的Coplin缸中，室温。
3. 用镊子小心的揭开封片胶，移去盖玻片，去掉玻片上多余的封片胶。
4. 将玻片浸在2X SSC中2分钟。
5. 快速将玻片转移到72±2℃的0.5X SSC中，放置至少5分钟，不要抖动。
6. 将玻片转移到装有2X SSC/0.1% NP40的Coplin缸中，放置10分钟。Coplin缸应用锡纸包好。

3.9.4.  负染

1. 准备0.05 μg/mL DAPI/抗淬灭剂（AF）。
2. 向标准玻片上加入10 μL DAPI/AF，向多孔玻片上每孔加入3-5 μL DAPI/AF。
3. 盖上盖玻片并用纸巾去掉多余的DAPI。
4. 储存在暗处直到用荧光显微镜进行观察（见注解9）。

3.10. 检测D-FISH

玻片可以在4℃的暗处储存2-3个礼拜而不损失荧光信号，但最好是在实验结束后马上进行观测。

商业探针如Vysis LSI BCR-ABL Dual Colour Translocation probe是用红色和绿色荧光素进行直标的，为了得到最佳的观察效果，需要一台配备有100-W 汞灯的荧光显微镜以及下面列举的其中一种滤光片：

• 合适的单通滤光片（包括DAPI滤光片用于观测负染信号）。
• 合适的双通滤光片+DAPI滤光片。
• 合适的三通滤光片。

1. 首先用低倍镜寻找合适的观察区域（10倍物镜），打开荧光显微镜并切换到DAPI滤光片。
2. 寻找合适的待观察IP/MP细胞（与细胞浆分离且与相邻细胞不接触）。
3. 在盖玻片上加上镜油并切换到100倍物镜。
4. 正确的聚焦在细胞上，切换到合适的滤光片（红或绿）。
5. 记录下观察到的图像，切换到下一个滤光片并记录图像。
6. 观察完第一个细胞后，按一定的顺序检查玻片。切换到DAPI滤光片，行与行之间重叠地在垂直方向上检查整个目标区域（见图1）。
7. 在扫描过程中，寻找合适的细胞并进行记录，避开那些细胞重叠或被胞浆和碎片包围的细胞。
8. 继续扫描记录直到规定的细胞数被记录。一般记录100个细胞可以避免统计学上的错误。

3.10.1. 杂交图像

1. 以Vysis LSI BCR-ABL Dual Colour Translocation Probe为例，当细胞没有t(9:22)易位时，显示为两个红色点和两个绿色点（图2）。
2. 当细胞为标准的t(9:22)易位时，显示为两个黄色的融合信号、一个红色点和一个绿色点。黄色信号是因为一个红色信号和一个绿色信号因为易位的原因距离非常近，因此观察时显示为黄色。
3. 当使用单通道滤光片时，看不到融合信号，但切换滤光片时，红色信号和绿色信号将在同一个位置出现。

4. 注解

1. 甲酰胺具有致畸性。当使用甲酰胺时务必戴手套并在通风橱内操作。
2. 变性液必须在使用前新鲜配置，保证pH为7.0。
3. 在进行70℃以上的水浴时，优先考虑使用玻璃Coplin缸。塑料Coplin缸可能无法准确地保持温度，尤其是同时操作多块玻片时。
4. 荧光见光会淬灭，因此尽量避光操作。探针可能被DNA酶降解，因此使用时必须戴手套，移液器枪头、塑料和玻璃用品都必须清洁且不含DNA酶。
5. 骨髓和外周血标本可能有传染性，因此在操作这些标本时必须戴手套并穿实验服。所有对暴露标本/细胞培养皿进行的操作都应该在2+级的生物安全橱中进行。为避免空气污染，使用带封闭桶的离心机。
6. 玻片的质量对FISH的成功至关重要。细胞核周围可见的胞浆成分会严重影响杂交。为得到理想的结果，FISH操作应该和玻片制备同天进行。
7. 玻片上固定的细胞数不应少于1000/孔，因为不是所有的细胞都粘附在孔中，太少的细胞会影响后续的观察。
8. 可使用Tween代替NP40进行杂交后洗，两个Coplin缸中分别盛2X SSC + 0.3% Tween和2X SSC +0.1% Tween，过程同3.9.3.。
9. 玻片可在4℃暗处保存2-3星期而不失去全部的荧光，但最后在FISH操作完后及时进行检测。
10. 在约15%的Ph+ve CML病例中，变异的9号染色体带有变异断裂点旁边的缺失，使用D-FISH检测时，表现为变异的信号（一个单独的融合信号和单独的红、绿信号）。这种变异提示患者有较差的预后。需要检测足够多的细胞来确定是否是真的变异9号染色体缺失或只是随机的变异。

参考文献

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慢性淋巴细胞性白血病（chronic Lymphocytic leuke-mia, CLL）是世界上最常见的白血病种类，与其它白血病不同，不同CLL患者之间病情差别非常大。患者可能没有任何临床症状，一直健康地生活下去；也可能病情迅速恶化，几个月就离开人世。不仅如此，对于占患者总数80%，处于临床分期早期阶段的患者，治疗并没有明显作用。因此，对于CLL患者，如何在诊断初期便对其疾病进展情况、治疗有效性和生存期进行准确的预测显得尤为重要。

CLL的临床分期主要包括Rai或Binet分期法。这些方法依靠体格检查和常规实验室检验，虽然也对患者的生存期做出一定的预测，但并不准确，且无法对疾病的进展、药物治疗的有效性等做出评估（表1）。为了克服这个缺陷，在常规临床分期以外还有多种技术被采用以弥补其不足（表2）。

在诸多新兴的检测方法中，FISH技术以其准确、方便、客观的优势得以脱颖而出。

准确

FISH技术直接检测特定基因的变化情况。正常细胞转化为肿瘤细胞必然伴随着内部基因的变化，且这种变化往往比相关蛋白的表达、临床症状的变化都要早，因此检测基因的变化情况能更好地对疾病进展进行预测。

细胞中DNA的稳定性要远高于蛋白质，在样品处理过程中不容易对DNA造成损伤而影响检测结果，而蛋白质的检测就比较容易受到外界因素的影响。例如IgVH突变状态的主要标志物之一CD-38的检测就很容易受到时间因素的影响。

目前已利用FISH技术对CLL患者的预后进行多次回顾性实验，证明FISH的检验结果与患者的疾病进展、治疗的有效性、生存期长短密切相关，且与其它检测指标，如IgVH突变状态具有较好的一致性，可作为CLL患者预后判断的重要指标。

方便

在FISH技术开展以前，主要使用染色体条带技术对染色体变异情况进行检测。这种方法要求样本为分裂期细胞，而慢淋细胞在体外很难培养进入分裂期，只有40%左右的患者能检测出染色体异常。FISH技术对样本的要求相对宽松，可直接对间期细胞进行检测，检出率可达染色体条带技术的两倍。

FISH技术目前已经有一套相当规范的实验流程，一般1-3个工作日即可提供检验结果，比计算淋巴细胞倍增时间或培养细胞进行染色体条带分析大大节约时间。且操作难度低，不需要像使用ZAP70检测IgVH突变那样仔细分离细胞。

客观

FISH检测的结果以荧光信号计数为基础，过程相对客观，不同实验者之间的一致性好，且结果的阴/阳性判断有固定的标准，便于不同实验室直接比较实验结果。而染色体条带技术则主观性较强，依赖于实验者的个人经验；在使用CD-38、ZAP70等替代性标志物进行IgVH突变状态检测时也缺乏统一的评判标准，导致不同实验室之间的检查结果大相径庭。

常见生物标志物检测方法的优缺点见表3。

FISH技术的原理

肿瘤细胞常伴随着某些基因的突变，进而导致特定染色体区域的缺失、易位或扩增。根据DNA双链碱基配对的原理，设计与待检测区域DNA序列互补的单链核苷酸序列，并用荧光染料进行标记，制成检测用的探针。将检测细胞/组织的染色体暴露后进行高温变性，使其DNA双链解链，再与探针进行低温孵育，使探针与相配对的染色体序列杂交，最后在荧光显微镜下观察探针的荧光信号来判断这些探针所结合的染色体区域是否有突变（图1）。

FISH技术检测结果的判断非常客观，具有明确的阳性诊断标准。常见的染色体异常在FISH技术里主要表现为荧光信号数量的变化或相对位置的变化（图2）。

CLL预后相关的染色体变异

如前所述，FISH技术检测的是染色体变异，因此，只有知道疾病可能涉及的染色体变异，才能选择合适的探针。经FISH检测，80%的CLL患者具有染色体变异，其中与预后诊断相关的主要有：

13q14 缺失

13q14缺失是CLL患者中最常见的染色体变异，出现率超过50%（核型分析阳性率为20%），而且往往是唯一的染色体变异。在这些患者中，70%为单侧染色体变异，双侧变异或嵌合型变异各占15%，单侧变异的患者预后相对较好。

具有13q14缺失的患者平均生存期与染色体正常者类似，约133个月。

12染色体三体

12染色体三体在CLL患者中的检出率为16~25%（核型分析为15~20%），这种变异对患者的影响还不是很明确，但一般伴随着高疾病分期和高肿瘤增生率。 此外，此类患者常伴有肿瘤细胞表面标志物异常，如CD20高表达和CD23缺失等。

ATM 基因（11q23）缺失

ATM基因编码的蛋白能通过p53蛋白依赖性的信号通路诱导细胞凋亡，并参与细胞周期调节、DNA损伤修复等多种生理过程。ATM基因的失活会极大的增加患癌症的风险。

ATM 缺失的检出率为11~18%。此类染色体异常多发生在年轻患者身上，患者疾病进展快，临床分期高，常伴有淋巴瘤，生存期平均为79个月。

p53 基因（17p13）缺失

p53 基因是最重要的抑癌基因，能诱导DNA损伤的细胞进行凋亡。一半以上的肿瘤细胞都伴有 p53 基因的失活。

p53 基因的缺失关系到患者的治疗有效性，具有此类突变的患者用烷化剂和嘌呤类似物治疗无效，而不具突变的患者用嘌呤类似物治疗的有效性达56%。另外，嘌呤类似物治疗后复发的患者中也多伴有 p53 基因的缺失。

p53基因缺失的检出率为7~8%，患者平均生存期仅有32个月。

6q22-23缺失

此区域主要涉及 myb 原癌基因，其缺失标志着CLL患者可能加速转变为幼淋巴细胞性白血病，患者预后较差。

多重异常

部分13q14区域缺失患者同时也伴随着 ATM 基因缺失或 p53基因的缺失。13q14 区域和 p53 基因同时缺失的患者平均年龄比 13q14区域单缺失的患者大，提示此类变异可能是疾病进展过程中在后期出现的。伴随出现 p53 基因缺失的患者预后较13q14区域单缺失的患者差。

结语

FISH技术克服了传统核型分析中需培养细胞、检出率低、辨识复杂的缺点，随着探针品种的进一步完善（表4），必将逐步取代核型分析在临床检验中的地位。

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Chronic lymphocytic leukaemia profiled for prognosis using a fluorescence in situ hybridisation panel, Br J Haematol, 2006, 132(6): 705-22.

首先，成功率！杂交仪可以大大提高您实验的成功率。全程由机器程序控制的变性、复性过程避免了手工操作过程中的不确定性，同时也避免了甲酰胺、水浴锅等因素造成的影响。一次FISH实验仅探针便价值逾千元，如果因为操作失误而导致实验结果作废，损失相当惨重。若干次实验失误的损失便足以购买一台杂交仪了。

其次，效率！杂交仪可大大增进您工作的效率，一台ThermoBrite杂交仪可同时进行12个样本的杂交工作，试想，如果您要同时手工操作12个样本的变性、梯度脱水，干燥、加探针、预热杂交盒、杂交的过程，是一件多么繁琐且耗时的工作！在这个时间就是金钱的年代，把时间和精力花在这些流程化的操作上无疑是巨大的浪费，更不提手工操作中失误造成的损失了。

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FISH检测要求使用中性福尔马林（不恰当的pH值会损伤DNA）固定24-48小时。

固定时间不足会导致组织较软，在预处理过程中会丢失部分组织和信号。

固定时间过长导致组织变脆，不利于切片，也会导致大分子交联情况严重，很难进行消化。

雅培公司的LSI EGFR/CEP 7探针组合一直被广泛运用于NSCLC患者的EGFR基因扩增临床检测，并取得了良好效果。该组合包括两种探针，其一是橘色荧光标记的EGFR探针，另一种是绿色荧光标记的CEP 7探针。前者位于7p12位置，从RH70813到SHGC-101379全长303kb；后者位于7p11.1-q11.1（D7Z1）区域，如图1所示。临床检测时，CEP 7探针作为EGFR基因的扩增的内参，统计EGFR与CEP7的两种信号的数目，然后将两者的比值作为判断阳性和阴性的依据（图2、3）。

EGFR探针设计图

端粒                       7p12区域                     着丝粒

图1： EGFR探针位点示意图

图2：A、B两图是很适合判断的样本，都有着清晰的细胞核轮廓而且有着优秀的荧光信号。C-F图中样本都是适合用于观察，C图中有些核染色质缺失了，D图中有些自身发光的荧光结构从而导致探针信号模糊，E图中细胞核的轮廓不清晰，F图中荧光信号很差。

图3：EGFR FISH结果判读

图3：A图里面CEP7探针存在交叉杂交从而导致有多个非特异性的目标出现多个微弱的绿色信号。B图中存在特定的背景杂讯从而出现大的红色荧光信号。C图出现了粘团状的绿色信号。D图中绿色信号很黯淡，而红色信号呈现斑块状。

如何有效检测EGFR基因的扩增需要遵循一些指导方针。

第一，要注意样本的制备和储存。样本的固定和储存要注意固定的时间和固定剂的种类，样本应该在10%的中性福尔马林或4%的普通甲醛中固定最少6小时最多不超过48小时，如果有条件的话应该把这些针对不同样本的参数记录下来。Bouin’s这种含水银的固定剂和任何可能损坏DNA的固定剂不能用于处理样本。最理想的肿瘤样本应该被福尔马林固定和石蜡包埋后储存在室温而不是处在组织切片状态。在肿瘤样本的选择上面，在做FISH实验之前最好先用HE染色标好肿瘤区，这样才能保证足够多的具代表性的肿瘤能被用于诊断。在切片制备上最好保证切片厚度为4微米左右（变动范围为1微米），因为只有这样才能保证不掉片的情况下能保证细胞信号的完整。

第二，要注意如何保证EGFR的FISH信号。实验室应该有一套针对福尔马林固定、石蜡包埋的组织进行检测的标准操作步骤。应该被关注的是一些特定步骤会对实验结果造成影响。脱蜡的步骤必须去掉所有的残留的蜡，所以推荐在脱蜡的时候最好用新鲜的溶液。蛋白酶的消化要根据一些特定的情况做改进，比如一些外科手术中取的的大的特定样本和一些小的活检组织可能需要不同的消化时间，在处理新鲜制备的和储存过一段时间的样本也要注意消化时间的不同。大量粘蛋白和致密纤维组织的样本往往需要更长的消化时间。杂交完成后，一般大小的盖玻片没有必要用橡胶水泥和指甲油来封片，但建议使用较大的盖玻片来防止镜油和DAPI混在一起。杂交片应该储存在-20度到4度之间直到分析完成。为了保证最好的荧光强度显微镜检测最好在一周内完成。

第三，要注意FISH信号的判读。对进行信号判读的医师应进行专业培训，他们必须具备肺癌病理学的知识，相关资质需要持续性的每年进行评估。相关的实验室的质控/质检推荐按照HER2检测指导方针来实施。EGFR的FISH样本的信号质量判定需要遵循一些规则，一旦试验对照片被评估和通过质量标准，每个肿瘤样本的质量必须被评估从而确认是否适合用于检测。要保证至少50%肿瘤细胞能被用于判读和计数，图3和图4中有适合和不适合的检测的细胞核的举例。要做出正确的判读要选对肿瘤区域和肿瘤细胞的核，所以建议由肺病理学家用HE染色来指出肿瘤病灶。在选取检测的细胞核时，用DAPI的滤光片来选取细胞核，选择5个区域每个区域大概10个细胞总共凑够50个。肿瘤细胞核进行信号判读时要用高倍放大的镜头，判读一般遵循这样的标准：（a）先用DAPI的滤光块选择大小比平均的体积大的而且没有染色质缺损和重叠的细胞核（图3）；（b）用绿色和红色的单通或者绿色/红色双通的滤光块来计数EGFR和CEP7。还应该要注意的是组织中要注意异质性的问题，这个异质性（由细胞外基质组分造成）会影响到蛋白酶对组织的消化，从而导致EGFR信号在不同区域强度不同。至于信号点的计数要注意对特殊情况的处理，图4、5中有一些总结。

图4，选择肿瘤细胞计数

图4：选择肿瘤细胞计数。A图中用DAPI滤光片选择了7个用于计数的肿瘤细胞核（标上箭头），这七个核都大于平均大小，而且染色质完整，有清晰的边缘，没有重叠。B图是同一张图合并了蓝色、红色和绿色（同样用箭头标记了），这些核里面每种探针至少有一个信号。所以所有7个核都适合被计数。

第四，对于EGFR的FISH结果的解释要根据Colorado评分标准，该标准是由Colorado大学制定的，用于判断NSCLC肿瘤的阳性及阴性结果，并被多个临床单位所使用。

FISH阳性：（A）样本必须有不少于40%的细胞出现不少于4个拷贝的EGFR信号。

（B）如果认为样本出现EGFR基因的扩增，需要下面这些标准中的一条：（a）在所有用于计数的细胞核中EGFR比CEP7不小于2，计算方法是在所有细胞中CEP7的信号不少于2个拷贝，先统计所有细胞核中两种信号的数目然后相除；（b）在不少于10%的肿瘤细胞中出现大于4个信号的基因簇；（c）至少有不少于10%的肿瘤细胞出现15个EGFR的信号。

FISH阴性：如果少于40%的肿瘤细胞出现不少于4个EGFR信号拷贝，就可以认为EGFR基因没有扩增。

综上所述，上面所述的指南能有效的指导FISH对于EGFR基因扩增的检测，希望我们的指南能帮助FISH成为NSCLC诊断的有力工具。

异常信号图像分析

图6：对一些常见的现象进行分析。A图中核里面出现两连体或三连体的信号这些信号被认为是一个信号。B-D图中EGFR基因成簇状扩增，这就导致了HSR（同质性染色区域）。这些成簇信号可能包括少数的点（B图中最多四个点），C图中信号数量处于平均水平，D图有很密集的信号点。E图中核里面的EGFR基因扩增得像有很多双微体。F图中核里面有成簇状的EGFR和CEP7信号。在每个核里面信号应该不断调节焦距来数尽可能精确的信号。如果信号多于15个就记为16个。

使用COT-1 DNA来降低FISH检测中的背景信号

图片来自Octavian Henegariu

在FISH检测中，过强的背景信号会严重干扰结果的判读，消除背景信号的方法包括：A，在标本预处理环节加入蛋白酶消化以去除细胞间杂质；B，增加杂交后洗环节的洗涤温度、时间，增加NP40的浓度或加入50%甲酰胺以去除未结合的探针；C，在探针中加入一定量的DNA竞争性阻断剂如COT-1 DNA或鲑精DNA来竞争性结合基因组中重复性片段。其中，使用竞争性阻断剂对于减少细胞核中无法通过反复杂交后洗去除的背景信号是一种有效的方法。

最常见的DNA竞争性阻断剂是COT-1 DNA，它适用于阻断人基因组中的Alu和L1家族序列，其效能是鲑精DNA的十倍。当FISH检测出现高背景，且排除预处理和杂交后洗过程中可能出现的问题时，实验者可适当加入1μg COT-1 DNA/10 μl 探针，以阻断可能引起非特异性结合的重复性序列，从而减少背景的产生。

加入200 μg COT-1 DNA，有明显背景信号存在。

加入1 μg COT-1 DNA后，背景信号明显减少。